Metodika asymetrické somatické hybridizace (u rodu Solanum)

Autorský kolektiv:
Ing. Marie Greplová,
Eliška Greplová,
Mgr. Hana Polzerová,
Ing. Jaroslava Domkářová, Ph.D., MBA

1 Cíl metodiky

Využití zdrojů rezistence klasickými šlechtitelskými postupy je silně limitováno. Tato skutečnost dává příležitost moderním biotechnologickým metodám, jakými jsou symetrická a asymetrická somatická hybridizace. Somatická hybridizace může překonat sexuální inkompatibilitu a poskytnout nové šlechtitelské materiály (Davey a kol. 2005). Symetrická somatická hybridizace rovnocenně kombinuje jaderný i mimojaderný genom, což je spojeno s větším výskytem nežádoucích vlastností planého druhu v nově získaném šlechtitelském materiálu. Asymetrická somatická hybridizace tento problém částečně řeší eliminací jaderného genomu planého rodiče tedy donora (Xia a kol. 2003, Liu a kol. 2005). Eliminace je prováděna pomocí záření (X, γ nebo UV), které způsobuje nevratné zlomy nebo fragmentaci chromozomů. Takovéto poškození zajišťuje omezení vlivu jaderné genetické informace donora (Zubko a kol. 2002, Jain a kol. 1988, Vlahová a kol. 1997).

Asymetrickou somatickou hybridizaci je možno provádět dvojím způsobem. Pokud je ošetřen jenom donor, pak fúzí neošetřených protoplastů a protoplastů s eliminovaným jádrem vzniká cytoplazmatický hybrid (cybrid) (Yarrow 1999, Guo a kol. 2004). Druhou cestou je ošetření donora i recipienta. Recipient (kulturní druh) je ošetřen metabolickými inhibitory jako jodooctovou kyselinou, jodoacetamidem nebo rhodaminem (Matibiri a Mantell 1994, Yarrow 1999, Polzerová a Greplová 2008). Ošetření donora současně s recipientem slouží jako efektivní selekce (Matibiri a Mantell 1994), protože pouze heterofúzované protoplasty přežívají díky komplementaci metabolismu (Liu a kol. 2005).

Získání asymetrických somatických hybridů je cenné zvláště tím, že umožňuje přenos žádoucích vlastností planého druhu a zároveň redukuje nutnost velkého počtu zpětných křížení (Fosberg a kol. 1998).

Shrnutí: Cílem asymetrické fúze protoplastů je umožnit přenos žádoucích genů, resp. vlastností z planých druhů rodu Solanum do kulturního Solanum tuberosum. Takový přenos není dosažitelný klasickými šlechtitelskými postupy. Asymetrická somatická hybridizace umožňuje omezit nežádoucí vliv jaderného genomu planého druhu, a získat tak nový šlechtitelský materiál přímo využitelný ve šlechtění.

2 Vlastní popis metodiky

Předkládaný metodický postup asymetrické fúze protoplastů elektrickým polem vyžaduje dostatek vhodného rostlinného materiálupro izolaci a ošetření protoplastů a po vlastní fúzi jejich kultivaci k dosažení regenerace rostlin. Vlastní metodika má tedy pět nedílných částí.

• Kultivace donorových rostlin
• Izolace protoplastů
• Ověření životnosti protoplastů a jejich ošetření
• Fúze protoplastů elektrickým polem
• Kultivace produktů fúze

2.1 Kultivace donorových rostlin

In vitro rostliny pěstujeme v klimatizační komoře s fotoperiodou 16 h/8 h světlo/tma (světelné podmínky: zářivky, typ světla – „daylight“, intenzita - 60 µmol m^-2 s^-1), při 22 °C. Rostliny kultivujeme na MS mediu bez hormonů (Murashige a Skoog 1962).

Rostliny určené pro izolaci protoplastů množíme na SH médiu bez hormonů (Schenk a Hildebrand 1972) obohaceném o AgNO₃ a Alar 85 (succinic acid dimethylhydrazide) - 10 až 20 rostlin odkaždého rodičovského genotypu. Rostliny necháme růst po dobu 4 - 6 týdnů. Den před izolací vystavíme rostliny chladu (10 °C) a tmě po dobu 24 hodin. Tyto stresové podmínky umožní synchronizaci buněčného cyklu, což se pozitivně odrazí v následné regeneraci protoplastů.

2.2 Izolace protoplastů

Celý proces izolace protoplastů probíhá ve sterilním prostředí.

Odtrhneme listy (z 10 rostlin, 0,5 - 1 g), rozřežeme je na malé kousky ostrým skalpelem v jedné Petriho misce (Ø = 5 cm) obsahující 5 - 6 ml roztoku enzymu (Bříza a Machová 1991) a Petriho misku utěsníme Parafilmem.

Petriho misky inkubujeme ve tmě přes noc (14 – 16 h) v termostatu při 25 ^oC; po uplynutí této doby zhodnotíme stav rostlinné tkáně pod mikroskopem; v některých případech (v závislosti na genotypu) umístíme Petriho misky na třepačku asi na15 min.

Rostlinnou tkáň s enzymatickým roztokem přeneseme pomocí jednorázové pipety s otevřeným koncem na sítko (velikost pórů 75 μm) umístěné na Petriho misce (Ø = 5 cm) a za jemného míchání propláchneme sítko sterilním roztokem 0,5 M sacharózy. Tímto krokem oddělíme uvolněné protoplasty od zbytku rostlinné tkáně. Takto získanou suspenzi protoplastů rozdělíme do centrifugačních zkumavek (8 ml) a převrstvíme roztokem W5 (Menczel a kol. 1981) o objemu 1 ml.

Centrifugujeme 12 min při 700 rpm.

Pasteurovou pipetou opatrně odsajeme plující protoplasty tvořící prstýnek na rozhraní použitých roztoků a umístíme je do nové centrifugační zkumavky, přidáme potřebné množství W5 (5 ml) a resuspendujeme.

Centrifugujeme 6 min při 500 rpm.

Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant, přidáme W5 (2 – 5 ml) a resuspendujeme pelet.

sCentrifugujeme 6 min při 500 rpm a Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant.

Od protoplastů každého genotypu odebereme vzorek (5 μl)na určení životnosti (viz 2.3.1) a zbylé protoplasty rozdělíme do dvou zkumavek. Jeden vzorek (1/4 celkového objemu vyizolovaných protoplastů) bude sloužit vždy jako kontrola. Druhý vzorek bude ošetřen buď UV zářením (planý druh) nebo metabolickým inhibitorem (kulturní druh).

Ke kontrole přidáme kultivační médium SW₁₁ (Bříza a Machová 1991), aby bylo dosaženo požadované hustoty 6×10⁵/ml (viz 2.3.2).

2.3 Ověření životnosti, úprava hustoty a ošetření protoplastů

2.3.1 Vyhodnocení životnosti protoplastů před fúzí

20 μl ředěného FDA + 20 μl suspense protoplastů pipetujeme na podložní sklo, vytvoříme preparát. Po 4 - 5 minutách vyhodnotíme preparát pomocí fluorescenčního mikroskopu. Ve vybraném zorném poli bez UV světla spočteme protoplasty a následně zeleně svítící protoplasty v UV světle (zeleně svítící protoplasty jsou živé). Vypočteme procentní podíl životných protoplastů z celkového počtu protoplastů v zorném poli. Při životnosti nad 50 % je zkoumaná suspenze použitelná pro fúze.

2.3.2 Určení hustoty protoplastů pomocí Bürkerovy komůrky

Určení hustoty protoplastů před fúzí (před kultivací) probíhá ve sterilním prostředí.

K naizolovaným protoplastům přidáme Pasteurovou pipetou přiměřené množství (2 – 4 ml) předfúzního roztoku (Schilde-Renschler a Ninneman 1988), resuspendujeme (v tomto roztoku mohou protoplasty pobývat až 2 hodiny v lednici při 6 – 7 ^oC) a určíme hustotu protoplastů pomocí Bürkerovy komůrky.

Zhotovíme preparát, počítáme protoplasty v pěti 3× orámovaných čtvercích (tj. čtverce o straně 1 mm), vlevo a nahoře počítáme všechny buňky dotýkající se střední linky, vpravo a dole tyto nepočítáme. Stanovíme průměrný počet protoplastů z pěti čtverců, což odpovídá hodnotě „X“. Koncentrace buněk v 1 ml pak je: „X“ × 10⁴ (1 čtverec reprezentuje objem 0,1 mm³ tj. 10^-4 cm³ [1 cm³ = 1 ml]).

Celkový počet protoplastů z hmoty listů = V_suspenze × „X“ × 10⁴

Faktor ředění Fř = požadovaná hustota / „X“ × 10⁴

Výsledný objem suspense v požadované hustotě = V_suspenze / Fř

Následně podle potřeby upravíme koncentraci pro fúze (viz 2.4.1) nebo kultivace protoplastů.

2.3.3 Ošetření protoplastů UV zářením

Aplikaci UV záření provádí proškolená osoba, která je vybavena ochrannými prostředky (plášť s dlouhými rukávy, odolné nitrilové rukavice, laboratorní kalhoty a laboratorní obuv).

Při práci je nezbytné dodržet všechna bezpečnostní opatření dle platných předpisů.

Ošetření protoplastů UV zářením probíhá ve sterilním prostředí.

K naizolovaným protoplastům přidáme Pasteurovou pipetou přiměřené množství (2 – 4 ml) předfúzního roztoku (Schilde-Renschler a Ninneman 1988), resuspendujeme (v tomto roztoku mohou protoplasty pobývat až 2 hodiny v lednici při 6 – 7 ^oC) a ozáříme zářením UV-C s vlnovou délkou 240 nm v dávce 370 µW cm^-2 po dobu 10 minut. Podmínky ozáření vypočteme podle vztahu:

E = I × cosα / r² [W / m²]

I je zářivost daná vztahem: I = P / 4π [W / st]

P je výkon zdroje [W], r je kolmá vzdálenost od zdroje k ozařované ploše [m] a α je úhel od kolmice.

Obr. Schéma uspořádání experimentu

Určíme hustotu protoplastů podle bodu 2.3.2. Odebereme ¼ vzorku a pomocí SW₁₁ upravíme na požadovanou hustotu a dáme kultivovat. U zbývajícího vzorku pokračujeme podle bodu 2.4.1

2.3.4 Ošetření protoplastů metabolickými inhibitory

Aplikaci metabolických inhibitorů provádí proškolená osoba, která je vybavena ochrannými prostředky (celoobličejová maska s ventilací přes filtry, plášť s dlouhými rukávy, odolné nitrilové rukavice, laboratorní kalhoty a laboratorní obuv).

Při práci je nezbytné dodržet všechna bezpečnostní opatření dle platných předpisů.

Ošetření protoplastů metabolickými inhibitory probíhá ve sterilním prostředí.

K naizolovaným protoplastům přidáme roztkok metabolického inhibitoru (na 1 ml suspenze 5 ml roztoku).
Směs protoplastů jemně promícháme Pasterurovou pipetou. Účinnou látku necháme působit 30 minut. Centrifugujeme 6 min při 500 rpm.Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant, přidáme W5 (8 - 9 ml) a resuspendujeme pelet.Centrifugujeme 6 min při 500 rpm a Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant a celý proces promývání v roztoku W5 opakujeme.Centrifugujeme 6 min při 500 rpm, odstraníme supernatant, odebereme ¼ vzorku a pomocí SW₁₁ upravíme na požadovanou hustotu a dáme kultivovat. U zbývajícího vzorku pokračujeme podle bodu 2.3.2.

2.4 Fúze protoplastů elektrickým polem

2.4.1 Úprava koncentrace protoplastů před fúzí

Centrifugujeme 3 min při 500 rpm a Pasteurovou pipetou odstraníme supernatant. Celý proces fúze protoplastů probíhá ve sterilním prostředí.

Pasteurovou pipetou přidáme fúzní roztok (Schilde-Renschler a Ninneman 1988), aby byla dosažena požadovaná koncentrace protoplastů pro fúzi 6×10⁵/ml a protoplasty resuspendujeme.

Smícháme suspenze protoplastů dvou fúzních partnerů (UV ozářené a ošetřené metabolickým inhibitorem) v poměru 1:1.

2.4.2 Fúze protoplastů

Fúze protoplastů je uskutečněna pomocí elektroporátoru (ECM 2001, BTX, Inc., San Diego, CA) a příslušenství (mikroskop, držák na fúzní komůrky, fúzní komůrky). Mikroskop umístíme do flow-boxu, před fúzí vysterilizujeme komůrky 70% alkoholem a necháme vyschnout. Po vyschnutí naneseme Pasteurovou pipetou 20 - 30 μl suspenze protoplastů do elektroporační komůrky, umístíme do držáku, celý proces fúze sledujeme v invertním mikroskopu.

Proces fúze protoplastů: protoplasty se nechají seřadit za působení střídavého proudu (AC field), poté je aplikován puls stejnosměrného proudu (DC pulse), který vede k fúzi.

Základní parametry elektrického pole

AC 5 V/komora se vzdáleností elektrod 0,5 mm 2 – 18s

DC puls 10 V/ komora se vzdáleností elektrod 0,5 mm 80 μs

AC 30 V/komora se vzdáleností elektrod 3,2 mm 2 – 18s

DC puls 60 V/ komora se vzdáleností elektrod 3,2 mm 80 μs

Po fúzi umístíme protoplasty z pěti komůrek Pasteurovou pipetou do jedné Petriho misky (Ø = 3,5 cm), k suspenzi protoplastů přidáme 1 ml kultivačního média (tekuté SW₁₁, Bříza a Machová 1991). Petriho misky zatěsníme Parafilmem, přemístíme je do termostatu a kultivujeme ve tmě při 25 ^oC. Další kultivace dle protokolu kultivace produktů fúze protoplastů.

2.5 Kultivace produktů fúze protoplastů

Celý proces kultivace produktů fúze probíhá ve sterilním prostředí.

První buněčné dělení se obvykle uskuteční 2 – 3 dny po fúzi (ověříme pod mikroskopem), po vytvoření buněčné stěny přidáváme v intervalu 7 – 10 dní tekuté médium SW₁₁ se snižující se hladinou osmotika až do stádia mikrokalusů (tj. postupně SW₁₁ 0,5M manitol, SW₁₁ 0,4 M manitol, SW₁₁ 0,3M manitol, Bříza a Machová 1991). Po vytvoření buněčné stěny možno kultivovat na světle (16 h fotoperioda/ 22 ^oC; světelné podmínky: fluorescenční zářivky – „daylight“, 150 µmol m^-2 s^-1).

Mikrokalusy se formují 3 – 4 týdny po fúzi, jsou-li již viditelné - provádí se výměna média. Médium SW₁₁ odsajeme a nahradíme tekutým médiem Shepard C (Shepard a Totten 1977). Po 7 – 10 dnech výměnu 2x opakujeme.

Následně sterilně přeneseme kalusy do čistých Petriho misek. Kalusy kultivujeme v tekutém nebo agarem zpevněném médiu Shepard D (Shepard a Totten 1977) nebo modifikovaném médiu Shepard D – SG2 , výměnu média provádíme po 10 – 14 dnech až do regenerace stonků.

Regeneranty kultivujeme za stejných podmínek jako donorové rostliny pro izolaci protoplastů. Rostliny množíme do dvojic k následnému testování hybridity.

2.6 Použité roztoky, média a jejich příprava

2.6.1

• Murashige & Skoog médium
  MS (Duchefa Biochemie) 4,4 g
  sacharóza 30 g
  agar 8 g
  MS a sacharózu rozpustíme v 490 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme na objem 500 ml destilovanou vodou. Agar rozpustíme v 400 ml destilované vody a rozvaříme v mikrovlnné troubě nebo ve vodní lázni, doplníme na konečný objem (500 ml). Oba roztoky spojíme a promícháme a rozlijeme do kultivačních nádob (do výšky 1 – 2 cm) a zavíčkujeme. Nádoby s médiem sterilizujeme autoklávováním při 121 ^oC 20 min.
• Schenk & Hildebrand médium
  SH médium (Duchefa Biochemie) 3,2 g
  Vitamíny SH (Duchefa Biochemie) 1,01 g
  sacharóza 15 g
  AgNO₃ 0,003 g
  Alar 0,0015 g
  Agar  8 g
  Kromě agaru vše rozpustíme v 490 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme na objem 500 ml destilovanou vodou. Agar rozpustíme v 400 ml destilované vody a rozvaříme v mikrovlnné troubě nebo ve vodní lázni, doplníme na konečný objem (500 ml). Oba roztoky spojíme a promícháme a rozlijeme do kultivačních nádob (do výšky 1 – 2 cm) a zavíčkujeme. Nádoby s médiem sterilizujeme autoklávováním při 114 ^oC 20 min.

2.6.2

• Enzymatický roztok
  Zásobní roztok:
  CaCl₂.2 H₂O 0,735 g
  MES 1,952 g
  Sacharóza 171,15 g
  NAA 0,005 g (zásobní roztok 100 mg/100 ml, sterilizace filtrací)
  ZT 0,002 g (zásobní roztok 50 mg/100 ml, sterilizace filtrací)
  Navážku bez růstových regulátorů rozpustíme v 480 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8. Zásobní roztok sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Po sterilizaci přidáme růstové regulátory a doplníme sterilní destilovanou vodou na 500 ml. Rozdělíme po 50 ml do uzavíratelných nádob. Roztok je možné zamrazit na – 20 ^oC. [ZT = zeatin; NAA = alpha-naphthylenacetic acid; MES = 2 – (N- morpholino)ethanesulfonic acid].
  
  Příprava enzymů:
  Celuláza Onozuka R-10 (Duchefa Biochemie) 1 g (respektive 1 U)
  Macerozym R-10 (Duchefa Biochemie) 0,2 g (respektive 0,2 U)
  Navážku rozpustíme, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a doplníme do 50 ml destilovanou vodou a sterilizujeme filtrací. Případně navážku přepočteme podle „U“ jednotek uvedených na etiketě konkrétního balení enzymu.
  
  Pracovní roztok enzymů:
  50 ml enzymů smícháme ve sterilních podmínkách s 50 ml zásobního roztoku (případný přebytek pro uchování zamrazíme na – 20 ^oC až na 1 měsíc).
• 0,5 M sacharóza
  Sacharóza 171,15 g
  rozpustíme v destilované vodě na konečný objem 1000 ml, sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min, uchováváme v chladu při 6 – 7 ^oC.
• Roztok W5
  NaCl 9,0 g
  KCl 0,8 g
  CaCl₂.2 H₂O 18,4 g
  Glukóza 1,0 g
  Glycin 1,0 g
  rozpustíme v 900 ml destilované vody, upravíme pH na 5,8 a doplníme destilovanou vodou na 1000 ml. Sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min, uchováváme v chladu při 6 – 7 ^oC.
  
  Koncentrovaný roztok W5: navážku rozpustíme v 400 ml destilované vody, upravíme pH na 5,8 a doplníme destilovanou vodou na 500 ml. Sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min, uchováváme v chladu při 6 – 7 ^oC.

2.6.3

• Roztok FDA (fluoresceindiacetát)
  FDA 0,005 g
  Zásobní roztok připravíme rozpuštěním navážky v 1 ml acetonu. Pracovní roztok: 20 μl zásobního roztoku přidáme do 1 ml kultivačního roztoku, sacharózy nebo W5.
• Roztoky metabolicky účinných látek
  Přípravu roztoků metabolicky účinných látek provádí proškolená osoba, která je vybavena ochrannými prostředky (celoobličejová maska s ventilací přes filtry, plášť s dlouhými rukávy, odolné nitrilové rukavice, laboratorní kalhoty a laboratorní obuv).
  
  Jodooctová kyselina 0,0186 g
  Zásobní roztok připravíme rozpuštěním navážky v 10 ml destilované vody. Sterilizujeme filtrací (0,22 µm).
  Pracovní roztok připravíme smícháním 200 μl zásobního roztoku účinné látky s 5 ml koncentrovaného roztoku W5 a doplníme na 10 ml sterilní destilovanou vodou.
  
  Jodoacetamid 0,0185 g
  Zásobní roztok připravíme rozpuštěním navážky v 10 ml destilované vody. Sterilizujeme filtrací (0,22 µm).
  Pracovní roztok připravíme smícháním 400 μl zásobního roztoku účinné látky s 5 ml koncentrovaného roztoku W5 a doplníme na 10 ml sterilní destilovanou vodou.

2.6.4

• Předfúzní roztok
  Manitol 7,4 g
  CaCl₂. 2H₂O 0,011 g
  rozpustíme v 90 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 a doplníme destilovanou vodou na 100 ml. Sterilizujeme autoklávováním při 121 ^oC 20 min.
• Fúzní roztok
  Manitol 7,4 g
  rozpustíme v 90 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 a doplníme destilovanou vodou na 100 ml. Sterilizujeme autoklávováním při 121 ^oC 20 min.

2.6.5

• Médium SW₁₁ 

rozpustíme v 900 ml destilované vody, upravíme pH na 5,6 – 5,8 a sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Sterilně přidáme Zeatin a NAA a doplníme sterilizovanou destilovanou vodou na 1000 ml, uchováváme v chladu při 6 – 7 ^oC.
* Zeatin - zásobní roztok 50 mg/100 ml sterilizujeme filtrací. NAA - zásobní roztok 100 mg/100 ml sterilizujeme filtrací.

• Médium Shepard C a Shepard D

rozpustíme v 900 ml destilované vody, upravíme pH na 5,8 a sterilizujeme v autoklávu při 121 °C 20 min. Sterilně přidáme NAA, IAA, zeatin, BAP popř. kyselinu giberelovou (viz výše) a doplníme sterilizovanou destilovanou vodou na 1000 ml, uchováváme v chladu. Shepard D připravujeme buď tekuté médium nebo s agarem, agarem zpevněné médium rozléváme do Petriho misek ve flow-boxu.

* Zeatin - zásobní roztok 50 mg/100 ml sterilizujeme filtrací. NAA - zásobní roztok 100 mg/100 ml sterilizujeme filtrací. IAA - zásobní roztok 100 mg/100 ml sterilizujeme filtrací.  BAP – zásobní roztok 50 mg/100 ml sterilizujeme filtrací.

2.7 Kontrola sterility použitých roztoků

Všechny roztoky před každým použitím zkontrolujeme bakteriálním testem: 1 ml roztoku + 1 ml provokačního média. Kultivujeme ve tmě při 25 ^oC po 3 – 4 dnech hodnotíme (přítomnost infekce je indikována mléčným zabarvením roztoku).

Provokační médium: Standard I nutrient broth for microbiology (Merck) – 25 g/l

2.8 Hodnocení regenerantů

Pro ověření ploidie doporučujeme použít průtokovou cytometrii (http://lmcc.ieb.cz/book/analysis-ploidy-level). Asymetrické somatické hybridy je vhodné ověřit některou z metod analýzy jaderné DNA např. RAPD (Greplová a kol. 2007) a analýzy mitochondriální a plastidové DNA (Bastia a kol. 2001, Harding a Millam 2000, Lössl a kol. 2000). 

3 Seznam použité související literatury

• Bastia T, Scotti N, Cardi T (2001) Organelle DNA analysis of Solanum and Brassica somatic hybrids by PCR with ‘universal primers’. Theor Appl Genet 102:1265-1272
• Bříza J, Machová I (1991) Regeneration of plants from leaf mesophyll protoplasts of the tetraploid potato cultivars Xenia and Bintje. Biologia plantarum 33 (3): 225-233
• Davey MR, Anthony P, Power JB, Lowe KC (2005) Plant protoplast technology: Current status. Acta Physiologia Plantarum, 27: 117-129
• Fosberg J, Dixelius C, Lagercrants U, Glimelius K (1998) UV dose-dependent DNA elimination in asymmetric somatic hybrids between Brassica napus and Arabidopsis thaliana. Plant Sci., 131: 65-76
• GreplováM, PolzerováH, KreuzL (2007) Protoplast fusion by electric field at the model material S. tuberosum L. Scientific studies 15 – Potato Research Institute Havlíčkův Brod, 2007: 71-83
• Guo WW, Prasad D, Cheng YJ, Serrano P, Deng XX, Grosser JW (2004) Targeted cybridization in Citrus: transfer of Satsuma cytoplasm to seedy cultivars for potential seedlessness. Plant Cell Rep., 22: 752-758
• Harding K, Millam S (2000) Analysis of chromatin, nuclear DNA and organelle composition in somatic hybrids between Solanum tuberosum and Solanum sanctae-rosae. Theor Appl Genet 101:929-947
• Jain SM, Shahin EA, Sun S (1988) Interspecific protoplast fusion for the transfer atrazine resistance from Solanum nigrum to tomato (Lycopersicon esculentum L.). Plant Cell Tiss. Organ Cult., 12: 189-192
• Liu J, Xu S, Deng X (2005) Intergeneric somatic hybridization and its application to crop genetic improvement. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 82: 19-44
• Lössl A, Götz M, Braun A, Wenzel G (2000) Molecular markers for cytoplasm in potato: male sterility and contribution of different plastid-mitochondrial configurations to starch production. Euphytica 116:221-230
• Matibiri EA, Mantell SH (1994: Cybridization in Nicotiana tabacum L. using double inactivation of parental protoplasts and post-fusion selection based on nuclear-encoded and chloroplast-encoded marker genes. Theor. Appl. Genet., 88(8): 1017-1022
• Menczel L, Nagy F, Kiss ZR, Maliga P (1981) Streptomycin resistant and sensitive somatic hybrids of Nicotiana tabacum + Nicotiana knightiana: correlation of resistance to N. tabacum plastids. Theor Appl Genet 59: 191-195
• Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15: 473-497
• Polzerová H, Greplová M (2008) Introduction to cybridization between Solanum verrucosum and Solanum tuberosum. Vědecké práce – Výzkumný ústav bramborářský, Havlíčkův Brod, 16: 65-75
• Schenk RU, Hildebrandt AC (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Can J Bot 50: 199-204
• Shepard FJ, Totten RE (1977) Messophyll cell protoplasts of potato. Plant Physiol 60: 313-316
• Simko I (2002) Comparative analysis of quantitative trait loci for foliage resistance to Phytophthora infestans in tuber-bearing Solanum species. Amer J Potato Res 79: 125-132
• Schilde-Renschler L, Ninnemann H (1988) Kombination von Kartoffellinien durch Protoplastenfusion zur Regeneration tetraploider züchterisch nutzbarer Hybidpflanzen. Vortr Pflanzenzüchtg 14: 149-163
• Vlahova M, Hinnisdaels S, Frulleux F, Claeys M, Atanassov A, Jacobs M (1997) UV irradiation as a tool for obtaining asymmetric somatic hybrids between Nicotiana plumbaginifolia and Lycopersicon esculentum. Theor. Appl. Genet., 94: 184-191
• Xia GM, Xiang FN, Zhou AF, Wang H, Chen HM (2003) Asymmetric somatic hybridization between wheat (Triticum aestivum L.) and Agropyron elongatum (Host) Neviski. Theor. Appl. Genet., 107: 299-305
• Yarrow S (1999) Production of Cybrids in Rapeseed (Brassica napus). In: Hall, R.D. (Ed.): Plant Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol. 111. Springer: 211-224
• Zubko MK, Zubko EI, Gleba YY (2002) Self-fertile cybrids Nicotiana tabacum (+ Hyoscyamus aureus) with nucleo-plastome incompatibility. Theor. Appl. Genet. 105: 822-828

Poděkování

Autoři děkují oponentům RNDr. Pavlu Lízalovi, Ph.D. a Ing. Václavu Čermákovi za pročtení metodiky a cenné připomínky.

Metodika byla naplánována a je uplatněna a ověřena při řešení MSM 6010980701 „Molekulární a technologické základy produkce kvalitních brambor“.